Technical bulletin
Homogeneous Gut³Gel（ホモジニアス）
ヒト腸管粘液のホモジニアスモデル内で微生物試料をシリンジ形式で培養し、シーケンシングやメタボロミクス解析用の試料を調製するプロトコル。
Anatomical site
Intestinal
5 mL シリンジ
Product
再現性が高く、かつハイスループットな in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティを研究するうえで不可欠である。本キットは、ヒト腸管粘液を in vitro でモデル化することを目的として設計されている。
本プロトコルでは、シリンジ形式を用いて Homogeneous Gut³Gel 内で微生物試料を培養する方法、および下流解析のための試料調製手順を記載する。下流解析には、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれる。
Before you begin
- 以下の手順は単一株試料について記載しているが、共培養、微生物コンソーシア、複雑な微生物試料にも使用されている。
- 本キットのゲルは、大腸用ではブタ胃由来タイプIIIムチン 28.6 mg/mL と NaCl 0.57 mg/mL、小腸用ではムチン 14.2 mg/mL と NaCl 3.51 mg/mL を含む。組成は調整可能であり、カスタム組成も提供している。
- すべての器具および消耗品を滅菌し、無菌条件下、理想的にはクラス II バイオセーフティキャビネット内で操作すること。滅菌した 0.9%（w/v）NaCl 溶液を用意する。
Procedure
A微生物懸濁液の調製約 15 分
- 対象微生物（例：Escherichia coli）を適切な培地で対数増殖期まで培養する。
- 培養液を遠心分離して細胞を沈降させ、上清を除去する。
- 細胞ペレットを適切な培養培地で再懸濁する。
- 600 nm における光学密度を測定し、必要に応じて細胞濃度を調整する。
Critical ゲルが培養培地中で製造されている場合は、細胞ペレットを培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁すること。
BHomogeneous Gut³Gel での培養約 5 分
- シリンジのプランジャーを軽く押して、最初の 2～3 滴を廃棄する。
- 二重シリンジ混合法を用いて、手順 A で調製した懸濁液とゲルを体積比 1:1 で 6～7 回往復させて混合する。
- 内容物を 15 mL チューブに移し、正の変位ピペットで等量ずつマイクロチューブに分注する。
- シリンジコネクターがない場合：ゲルを滅菌済み 15 mL チューブに出し、各マイクロチューブに 500 µL を移し、同量の懸濁液を加えて優しくピペッティングして均質化する。
- 実験デザインに応じて、37 °C で好気または嫌気条件下、最大 72 時間培養する。
Note マイクロチューブの代わりに 24 ウェルプレートを使用できる。
Cゲルの溶解1 シリンジあたり約 5 分
- 各試料に Bac³Gel 溶解培地（200 mM クエン酸ナトリウム）を体積比 1:1 で加える。
- ゲルが完全に溶解するまで十分に混合する。均質化した試料は下流解析に使用できる。
Volumes for every plate format
Downstream analysis
シーケンシング
14,000 × g で 5 分間遠心分離し、ペレットを用いて DNA を抽出する。
メタボロミクス
14,000 × g で 10 分間遠心分離し、上清を回収して凍結乾燥する。
代謝活性または光学密度
14,000 × g で 5 分間遠心分離し、上清を除去して 0.9%（w/v）NaCl に再懸濁する。
その他の解析
細胞生存率の評価、フローサイトメトリー、標準的な微生物学的特性評価にも適している。
Troubleshooting
本製品は研究開発目的（R&D）のみに使用してください。
Questions about this protocol
contact@bac3gel.com