勾配型 Gut³Gel（結腸用）
ヒト結腸の粘液層モデルで糞便由来マイクロバイオータを培養し、シーケンシングやメタボロミクス解析用の試料を調製するためのプロトコル。
Product
再現性が高く、かつハイスループットな in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティを研究するうえで不可欠である。本キットは、ヒト結腸の粘液層を in vitro でモデル化することを目的として設計されている。
本プロトコルでは、マルチウェルプレート形式を用いて糞便試料を Gut³Gel 内で培養する方法、および下流解析のための試料調製手順を記載する。下流アッセイには、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれる。
Before you begin
- 以下の手順は糞便試料を用いる場合について記載しているが、本プロトコルは単一培養、共培養、微生物コンソーシアにも使用されている。
- 本キットの Gut³Gel は Brain Heart Infusion（BHI）培地中で製造され、ブタ胃由来タイプIIIムチンを 50 mg/mL 含む。標準製品は塩溶液中で製造されるが、本プロトコルでは BHI を使用した。組成は調整可能であり、カスタム組成も提供している。
- 架橋および酸素勾配は製造工程中に形成され、微生物の培養によって変化する。
- すべての器具および消耗品を滅菌し、無菌条件下、理想的にはクラス II バイオセーフティキャビネット内で操作すること。滅菌した 0.9%（w/v）NaCl 溶液を用意する。
Procedure
A糞便試料の処理約 15 分
- 新鮮な糞便試料を少なくとも 30 g 量り取り、滅菌済みのブレンダーに移す。糞便 30 g ごとに滅菌済み 0.9%（w/v）NaCl 溶液 150 mL を加え、均一なスラリーが得られるまで混合する。
- 大きな固形物を除去するため、スラリーを滅菌済みのざるで濾して滅菌容器に移す。50 mL チューブに分注し、使用まで氷上で保持する（1 時間を超えないこと）。
Tip 濾過したスラリーは分注し、グリセロールを最終濃度 10%（v/v）で添加して −80 °C で保存できる。微生物の多様性を保つため、できるだけ迅速に行うこと。
Critical 糞便試料はできるだけ新鮮なものを使用し、理想的には採取後 30 分以内に処理を開始する。微生物への機械的損傷を防ぐため、過度のブレンディングは避けること。
BGut³Gel での培養1 プレートあたり約 5 分
- Gut³Gel プレートを室温に戻す。本プロトコルでは 24 ウェルプレートを例として使用する。
- 各ウェルに糞便スラリーをゲルと体積比 1:1 で加える。24 ウェルプレートでは 1 ウェルあたり 700 µL。他のフォーマットは下表を参照。
- プレートに蓋をし、37 °C で好気または嫌気条件下、最大 72 時間培養する。
Note 分子（プロバイオティクスや活性成分など）の影響を評価する場合は、添加前に Gut³Gel 内で 37 °C、24 時間培養してマイクロバイオータを安定化させる。
Critical 糞便スラリーはゲルの上面に優しく加えること。混ぜないこと。培養前の嫌気条件は必須ではないが、絶対嫌気性菌の損失を防ぐことができる。
Cゲルの溶解1 ウェルあたり約 3 分
- ゲルを乱さないように上清を優しく吸引して除去する。24 ウェルプレートでは 0.9% NaCl 溶液 700 µL でゲルを洗浄し、上清を吸引して廃棄する。
- Bac³Gel 溶解培地（200 mM クエン酸ナトリウム）をゲルと体積比 1:1 で加え、ゲルが完全に溶解するまで十分に混合する。均質化した試料をマイクロチューブに移す。
Note 洗浄により、ゲルに定着した微生物のみを評価対象とすることができる。ウェルが大きい場合やエキソポリサッカライドが存在する場合、溶解に時間がかかることがある。
| プレート形式 | 1 ウェルあたりの Gut³Gel |
|---|---|
| 6 ウェル | 3,700 µL |
| 12 ウェル | 1,600 µL |
| 24 ウェル | 700 µL |
| 48 ウェル | 300 µL |
| 96 ウェル | 100 µL |
糞便スラリーおよび Bac³Gel 溶解培地は、いずれもゲルと体積比 1:1 で加えるため、表の体積と同量となる。
Downstream analysis
シーケンシング
溶解した試料を 14,000 × g で 10 分間遠心分離し、ペレットを用いて DNA を抽出する。
メタボロミクス
14,000 × g で 10 分間遠心分離し、上清を回収して凍結乾燥する。
その他の解析
細胞生存率の評価、フローサイトメトリー、代謝活性の測定、標準的な微生物学的特性評価にも適している。
Troubleshooting
ゲルが溶解しない、または溶解に時間がかかる
200 mM クエン酸ナトリウム溶液の量を増やして十分に混合する。ウェルが大きい場合やエキソポリサッカライドが多い培養では時間がかかる。
本製品は研究開発目的（R&D）のみに使用してください。